多重ELISAプロトコル

1.

フィルタプレートテンプレートを準備します。 標準、サンプル、およびブランクウェルを表示します。 標準とサンプルは、重複または3重コピーで実行する必要があります。 プレート全体を使用しない場合は、未使用の井戸をプレートシールでシールします。

重要:すべてのアッセイプロセス中にフィルタープレートをフィルタープレート蓋の上に置き、プレート底部が接触しないようにします。

2.

15秒間のボルテックス作動ビードサスペンション。

3.

各ウェルにキャプチャビーズ作業懸濁液45µLを追加する。 メモ: 残りのキャプチャビード作業用サスペンションを保存し、2~8℃で保管してください。 フローサイトメータの取得パラメータの設定に使用できます。

4.

フィルタープレート洗浄機の説明に従って調整された真空源に接続された「フロースルー」フィルタープレート洗浄機を使用して、ウェル内のバッファを除去します。

5.

バッファの「フロースルー」除去後に残ったバッファを取り除くには、プレート底を数層のペーパータオルに軽くたたいてください。

6.

各試料に30μLのCCS、SPBまたはTLアッセイバッファを添加する。 メモ: 細胞培養上清サンプルは、非常に低いレベル（20 pg/mL未満）のサイトカインが予想される場合、アッセイバッファで希釈することなく実行できます。 その場合は、この手順を省略し、ステップ 7 で各サンプルに 45 µL の細胞培養上澄みサンプルを追加します。

7.

各サンプルに15µLのサンプルをよく加えなさい。

8.

各標準ウェルに45µLの標準を追加します。

9.

プレートシールでプレートを覆いなさい。

10.

シェーカー（700rpmに設定）で室温で60分間インキュベートする。 フィルタープレートをアルミホイルで包んで光から保護します。

11.

プレートシールを取外します。

12.

真空源に接続されたフィルタープレートワッシャーを使用して、ウェル内の溶液を除去する。

13.

フィルタプレートワッシャを使用して、100 µL 1x洗浄バッファでウェルを3回洗浄します。

14.

最後に洗浄した後、プレート底を数層のペーパータオルで軽くたたいて、プレート底に残っている緩衝材を取り除きます。

15.

それぞれの井戸にビオチン化抗体加工液25µLを添加する。

16.

プレートシールでプレートを覆いなさい。

17.

シェーカー（700rpmに設定）で室温で30分間インキュベートする。 フィルタープレートをアルミホイルで包んで光から保護します。

18.

プレートシールを取外します。

19.

フィルタープレートワッシャーを使用して、ウェル内の溶液を除去する。

20.

フィルタプレートワッシャを使用して、100 µL 1x洗浄バッファでウェルを3回洗浄します。

21.

最後に洗浄した後、プレート底を数層のペーパータオルで軽くたたいて、プレート底に残っている緩衝材を取り除きます。

22.

各ウェルに25µLのストレプトアビジン-PE作業溶液を添加する。

23.

プレートシールでプレートを覆いなさい。

24.

シェーカー（700rpmに設定）で室温で20分間インキュベートする。 フィルタープレートをアルミホイルで包んで光から保護します。

25.

プレートシールを取外します。

26.

フィルタープレートワッシャーを使用して、ウェル内の溶液を除去する。

27.

100µL 1x洗浄バッファで井戸を2回洗浄する。

28.

皿の底を数層のペーパータオルに軽くたたいて、残留液を取り除きます。 2フローサイトメーターのサンプルロードメカニズムに応じて、150µL~300µLの読み取りバッファを各ウェルに追加してビーズを再停止します。

29.

プレートシールでプレートを覆いなさい。

30.

プレートをマイクロタイターシェーカーの上に置き、700rpmで30秒間振ります。 メモ: フローサイトメータに96ウェルプレートローダがなく、ビーズを再サスペンドするために読み取りバッファが200µL以上必要な場合は、プレートを振らないでください。 P200ピペットで上下6~8回ピペットを使用して各ウェルのビーズを再度吊り下げ、テストチューブに移し、入手します。

31.

プレートシールを取外します。

32.

フローサイトメーターで読みます。