TUNEL Staining:細胞死を測定するための選択方法

この記事では、TUNEL染色アッセイについて知っておくべきことをすべて説明します。 まず、トンネル染色とは何か、どのように作用するのかを説明します。

次に、使用可能なTUNELの種類について説明します。 次に、他の アポトーシスアッセイよりもTUNEL染色の利点を見てみましょう。

最後に、TUNEL染色を正しく行うためのヒントをいくつか紹介します。

TUNELアッセイはアポトーシス細胞死Aの原理に基づいています。 アポトーシスは、細胞がもはや機能できなくなった状況から自分自身を取り除くために自己破壊するプロセスです。 アポトーシスが起こるためには、まず細胞がDNA損傷を受けなければなりません。 DNA損傷が発生すると、細胞はカスパーゼとして知られている酵素を活性化します。 カスパーゼは、特定の部位でDNAを切断する酵素のファミリーです。 TUNEL細胞死滅アッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）として知られている酵素を使用することによって、この事実を利用します。

TdTは, カスパーゼ. によって切断されたDNA鎖の末端を認識し、結合することができます。 TdTがDNAに結合すると、DNA鎖の末端へのヌクレオチドの付加を触媒します。 このプロセスは Nick 変換と呼ばれます。 ヌクレオチドの添加はDNA鎖の新たな末端を作り出し、それを蛍光色素で検出することができます。 これがトンネル染色の原理です。

TUNEL染色を行う際には、細胞が適切に固定され、浸透していることが重要です。 これは、細胞をパラホルムアルデヒドのような固定溶液で少なくとも30分間培養することによって行うことができます。 その後、細胞は染色前にトリトンX-100のような洗剤で透過する必要があります。 TUNELアッセイを使用してアポトーシス細胞を検出するには、次の手順に従います:

- 細胞をパラホルムアルデヒドに30分間固定する

- Triton X-100による透過性

- TUNEL反応混合物で60分間培養する

- PBSですすぎ、Length Gold Antifade Regentなどの装着媒体を使用してスライドに装着します。

- 励起波長405nm、発光波長525nmを用いた蛍光顕微鏡による観察

TUNELのシミには2種類あります。 FITC-dUTPは感度が高く使いやすいため、最も一般的に使用される染色剤です。PI-dUTPは感度は低いが、光漂白に強いです。

TUNEL染色を行う際には、アポトーシス核を染色するためにDAPIのような陰性染色を使用することが重要である。 これはアポトーシス細胞のみを検出するのに役立ちます。 TUNELアッセイはアポトーシスに特異的ではなく、壊死細胞も検出することを覚えておくことが重要です。 偽陽性を避けるためには、スタウロスポリン処理細胞のような陽性対照群を使用することが重要である。

ストレプトアビジン-ビオチン結合体は、アポトーシス細胞を検出するためにdUTPの代わりに使用することもできます。 本方法では、TUNEL反応混合物にビオチンタグ付きヌクレオチドを使用する。 その後、ストレプトavidin-ビオチン結合体はビオチンタグに結合するために使用されます。 ビオチンタグのヌクレオチドは分解に対してより抵抗力があり、より強い信号を生成します。 この方法は、FITC-dUTP や PI-dUTP を使用するよりも感度が高いですが、価格も高く、広く利用できるわけではありません。

他のアポトーシス試験よりもTUNEL染色を使用することには、いくつかの利点があります。 第一の利点は、TUNEL染色がフローサイトメトリーや免疫組織化学のような他の方法と比較して、非常に敏感で特異的で使いやすいということです。 これは、TUNEL染色が細胞が広範囲なDNA損傷を受ける前の初期段階でアポトーシスを検出するために使用できることを意味します。

TUNEL染色のもう一つの長所は、固定された細胞に使用できるという点で、これはライブセルイメージングを行う必要がないことを意味する。 これは、ライブセルイメージングを実行することが難しく、高価な機器が必要な場合が多いため、大きな利点です。 これは、生きている細胞にのみ使用できるアネクシンVアッセイのような他のアポトーシスアッセイに比べて重要な利点です。 また、TUNEL染色は光漂白に強く、さまざまな細胞タイプに使用できます。

最後に、TUNEL染色をダピやヨウ化プロピジウムなどの他の染色と組み合わせて使用することで、細胞のより完全な画像を作成できます。 これは、ダピやヨウ化プロピジウムだけではDNA損傷を発見することが難しいため、アポトーシスの初期段階を調査する際に特に有用である。

トンネル染色を行う際に注意すべき重要なヒントがいくつかあります。

第一に、新たに分離された細胞を使用することが重要です。 アポトーシス細胞はすぐに分解され、細胞が新鮮でないと検出が難しい可能性があるからです。 また、TUNEL染色を行う際には、新鮮な試薬を使用することも重要です。 長期間保管されている試薬は効果がない可能性があり、誤った否定的な結果につながることがあります。

第二に、希釈されたTUNEL染色を使用することが重要です。 これは、セルが正しく染色され、偽陽性が検出されないようにするのに役立ちます。 第三に、染色反応を最低15分間続けることが重要です。 最後に、結合していないTUNEL染色を取り除くためには、染色後に細胞を完全に洗浄することが重要です。

最良の結果を得るためには、染色条件を最適化する必要があります。 これにはいくつかの実験と試行錯誤が必要になるかもしれません。 このブログに記載されているヒントに従うことで、TUNELアッセイが正確で信頼性の高い結果を提供することができます。 これで、トンネル染色に関する包括的なガイドを終了します。 それが有益で役に立つことを願っています！