フローサイトメトリープロトコル | 10のヒントとヒント

フローサイトメトリーは、流体ストリーム中の細胞の特性を測定します。 複雑な細胞系（例えば、血液）の単細胞分析を非常に迅速に行うことができます（100s/秒）。また、細胞あたりの大きさ、粒度、蛍光強度などのさまざまな細胞特性を調べることもできます。

フローサイトメトリーは、細胞の数を数える、細胞の分類に使用できます、 バイオマーカー検出 そしてタンパク質工学。 細胞成分は蛍光標識された後、レーザーによって励起され、さまざまな波長で光を放射する。 フローサイトメトリーの結果により、どの細胞が活性化されているのか、または活性化されている経路が複数あるのかを正確に特定できます。

フロー サイトメトリーで選択できる 2 つのパラメータの例としては、Forward Scatter（FSC; 前方散乱）および Side Scatter Channel（SSC; 側面散乱チャネル）があります。 FSCの強度は粒子の大きさと関連があり、細胞の破片と生きた細胞を区別するのに使用できます。SSCは粒子の粒状含有量に関する情報を提供します。 FSC と SSC はすべてのパーティクルに対して一意であり、異なるセル タイプを区別するために使用できます。

以下では、フローサイトメトリー実験のヒントとヒントに加えて、2つのサンプルフローサイトメトリープロトコルを見つけることができます。

フローサイトメトリーサンプル固定のためのこのプロトコルは、細胞周期分析とDNAラベル作成のための迅速なプロトコルです。 このプロトコルは、 のフェーズの測定に役立ちます 細胞周期, ヨウ化プロピジウムで染色した場合、G1、SおよびG2/M。

1. 処理された試料からK562細胞を270 x gで5分間遠心分離して採取し、細胞をペレット化する
2. ペレットを邪魔することなく、上澄みを注意深く吸引する
3. 氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）でペレットを洗浄する
4. 270 x gで5分間遠心分離する
5. 200 µl の PBS でセルを再サスペンドします
6. 試料分析の前に、一晩4℃で培養する前に氷冷エタノール（70%（v / v））2mlを添加する

1. 固定試料を270×gで5分間遠心分離する
2. エタノールを吸引し、PBS 500 µlで再懸濁する
3. RNase A（30mg / ml）とヨウ化プロピジウム（300µM）を加えて混合する
4. 分析する前に37℃で30分間暗闇の中で試料を培養する
5. 細胞周期プロファイルは、COULTER© EPICS© XL-MCLフローサイトメーターを使用して分析されました

このプロトコルFlowサイトメトリーは、CXCR4などの受容体の細胞表面発現に対する特定の治療の効果を決定するために使用されました。

1. 5×105細胞/mlのJurkat T細胞をシードし、血清フリーRPMI + 0.5% BSAで実験する前に2時間空腹
2. 不連続攪拌条件下で100ng/ml SDF-1αで細胞を刺激する
3. ベンチトップ遠心分離機850xgで30秒間遠心分離による活性化停止
4. 氷のように冷たいPBSで細胞を洗浄する
5. 1%BSA/PBSの細胞表面受容体に対してフィコエリチリン（PE）標識抗体で染色し、30分間氷でインキュベートする
6. 1%BSA/PBSで2回洗浄
7. 氷の上で1%のPFAを固定
8. 4℃で最大24時間保存、またはフローサイトメトリーにより直ちに分析

1. 受容体の細胞表面発現、例えばCXCR4DAKO CyAn ADP (Advanced Digital Processing) で測定された
2. 結果は、関連するDako Summit（バージョン4.3）ソフトウェアを使用して分析され、ヒストグラムが生成されました。 その後、データは統計分析を受け、グラフパッドプリズムを使用してグラフ化されました。

これが実験の始まりであり、最も重要な部分です。 接着剤または組織由来の細胞を使用しているかどうかに関係なく、サンプル準備が完全に最適化されていることを確認します。 細胞が正しく収穫されない場合、これは細胞の生存率を低下させる可能性があります。 さらに、酵素的処置の使用は、研究されているマーカーの発現に影響を与えるべきではありません

すべての固定および透過性ソリューションがすべての実験環境で動作するわけではなく、検査される抗原によって異なる場合があります。

蛍光色を選択する前に、レーザー、フィルターの構成、および検討している蛍光色の発光スペクトル特性を知っておく必要があります。 また、使用する機器の機能についても理解しておく必要があります。 2つの細胞計は同じ能力を持っていません。 知識豊富なスタッフがいるフローサイトメトリーコアを持っている場合は、彼らのお気に入りの4色、5色、または6色パネルが何であるかを必ず聞いてください。 また、特定の機器における特定の色の制限がどのようなものであるかを示すこともできるはずです。 常に、低密度で発現する抗原を検出するには明るい蛍光色を選択し、高密度で発現する抗原を検出するには暗い蛍光色を選択してください。 蛍光色の選択は補償のためにも重要であり、「明るい」蛍光色がスペクトルオーバーラップに問題を引き起こす可能性も考慮する必要がある

すべての実験と同様に、最終的には検査が正しく機能しているかどうかを判断し、結果の重要な部分を形成できるため、コントロールの選択は重要です。 ワークフローには、次のタイプのコントロールを組み込むことを推奨します:

1. 1. 機器の電圧ゲインと補正を正しく調整するために使用する、セットアップまたは機器の制御
   2. 特定のバインディングと非特定のバインディングを区別するために使用されるゲート制御
   3. 生物学的に有意義な情報を提供するための実験的制御

次の表に、上記の 3 つのカテゴリそれぞれに関連する適切なコントロールを示します:

可能であれば、死んだ細胞を特定し除去することは、特定の染色を減らすのに役立ちます。 死んだ細胞は、膜の完全性が失われている細胞を貫通するDNA染料を使用して検出できます。

ダブレットは、2つの細胞がくっつき、1つとして分析されるときに発生します。 これにより、レーザー質問点を通過する「細胞」の蛍光強度が偽りで増加します。 Forward Scatter INT vs Forward Scatter Time-of-Flight（ToF; 前方散乱 INT 対前方散乱時間）または Side Scatter INT vs Side Scatter Time-of-Flight（ToF）を使用してウィンドウを作成することにより、ダブレットをゲートアウトします。 その後、細胞塊を除外するために、分析する前に細胞をフィルタリングします。

理想的な世界では、サンプルはすぐに分析されるべきですが、常にそうなるとは限りません。 試料を直ちに100µl固定剤（例えば、1~2%ホルムアルデヒド）で再分析し、最大24時間光から保護された状態で4℃で保存することができる場合。

フローサイトメトリー実験の最適化中の重要なステップは、試薬（抗体）滴定である。 これは、背景を最小限に抑えながら、蛍光信号の特異性と強度を向上させるのに役立ちます。

フローサイトメトリー実験の最適化中の重要なステップは、試薬（抗体）滴定である。 これは、背景を最小限に抑えながら、蛍光信号の特異性と強度を向上させるのに役立ちます。

環境光によるフルオロクロムの劣化を防止するために、着色または染色中の細胞を含むプレートまたはチューブは、試料を箔または他の遮光機構で覆うことによって保護されるべきである。