セル同期とは何ですか?

G1逮捕

ダブルチミジンブロック、血清飢餓。サイクリン依存性キナーゼ (CDK) の阻害

G2逮捕

微小管の阻害、サイクリン依存性キナーゼ (CDK) の阻害

G2/M逮捕

RO-3306

M相

タキソール、ノコダゾール

1.

G1/S 境界の細胞を同期させるために、新たに調製したチミジン溶液 (16 mM) を完全培地で調製し、0.22 μm フィルターディスクを使用してフィルター滅菌しました。

2.

細胞（１×１０^{７ ）を、１７５ｃｍ ３}の細胞培養フラスコ内で、チミジン（２ｍＭ）を含む６０ｍｌの完全培地中で１６時間培養した。

3.

次いで、細胞を完全培地（52.5 ml）に8時間再懸濁して、細胞を細胞周期に再び戻させた。

4.

細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、完全培地（１０ｍｌ）で２回洗浄した。細胞（１×１０^７）を、チミジン（２ｍＭ）を含む６０ｍｌの完全培地中で１６時間培養して、Ｇ１／Ｓ境界で細胞を同期させた。

5.

細胞の同期はフローサイトメトリーによって確認されました。

1.

細胞 (1 x 10 ⁷ ) をノコダゾール (100 nM) で 18 時間処理することで有糸分裂を同期させ、175 cm ^{2のチャンバー内で 37 °C でインキュベートしました。}

2.

細胞を完全培地X3で洗浄し、完全培地に再プレーティングし、放出後0、30、60、120および180分でサンプルを採取した。

3.

対照として、細胞を有糸分裂状態に維持するためにノコダゾール（100nM）の存在下で1つのサンプルを再播種し、放出後180分にサンプルを採取した。

4.

細胞をRIPA緩衝液中で溶解し、全細胞抽出物を調製した。サンプルは -20 °C で保存されました。

1.

K562 細胞は、前述のようにダブル チミジン ブロック (DTB) によって G1/S 期で停止しました (最初のサンプル プロトコールを参照)

2.

細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、完全培地（１０ｍｌ）で２回洗浄した。

3.

次いで、細胞(1×106/ml)を完全培地に再懸濁し、1時間放置した。

4.

細胞をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO) またはタキソール (1 μM) で 11 時間処理しました。DTB の 12 時間後、細胞をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO) またはキナーゼ阻害剤、BI2536 (10 μM)、ロスコビチン (20 μM)、RO-3306 (9 μM)、プルバラノール A (10 μM) で処理しました。 ) プロテアソーム阻害剤 MG-132 (10 μM) を 2 時間。

5.

細胞をRIPA緩衝液で溶解し、全細胞抽出物を調製した。

6.

サンプルは -20 °C で保存されました。

1.

細胞 (1 x 106) をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO)、タキソール (1 μM) またはノコダゾール (1 μM) で 12 時間処理しました。

2.

細胞をキナーゼ阻害剤ロスコビチン (20 μM) またはロスコビチンとプロテアソーム阻害剤 MG-132 (10 μM) で 2 時間処理しました。細胞を400×gで5分間の遠心分離によって回収し、30μlのRIPA緩衝液で溶解した。

3.

サンプルは -20 °C で保存されました。

1.

K562 細胞をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO) または RO-3306 (9 μM) で 18 時間処理しました。

2.

細胞を完全培地で３回洗浄し、ビヒクル（０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）またはＭＧ－１３２（１０μＭ）のいずれかで処理した完全培地１０ｍｌに再プレーティングした。

3.

サンプルは洗浄後 0、15、30、45、60、および 90 分に採取されました。

4.

K562細胞をRIPA緩衝液で溶解し、全細胞抽出物を調製した。

5.

サンプルは -20 °C で保存されました。

1.

70 % エタノールで細胞を固定し、透過性にします。

2.

40 μg/ml のヨウ化プロピジウムで染色し、25 μg/ml の RNase を加えます (RNA を分解し、DNA のみを確実に染色するため)。

3.

フローサイトメーターでサンプルを実行します。