フローサイトメトリープロトコル

以下に、フローサイトメトリー実験に関するヒントやコツに加えて、フローサイトメトリー プロトコルのサンプルを 2 つ示します。

フローサイトメトリー サンプル固定のこのプロトコルは、細胞周期分析と DNA ラベル付けのために細胞を準備するための迅速なプロトコルです。このプロトコルは、ヨウ化プロピジウムで染色したときに細胞周期の段階、G1、S、および G2/M を測定するのに役立ちます。

処理済みサンプルから K562 細胞を 270 x g で 5 分間遠心分離して細胞をペレット化します

固定したサンプルを 270 x g で 5 分間遠心分離します。

このプロトコル フローサイトメトリーは、CXCR4 などの受容体の細胞表面発現に対する特定の処理の効果を決定するために使用されました。

Jurkat T 細胞を 5 x105 細胞/ml で播種し、実験前に血清フリー RPMI + 0.5% BSA で 2 時間血清飢餓状態にします。

CXCR4 などの受容体の細胞表面発現は、DAKO CyAn ADP (Advanced Digital Processing) で測定されました

これは実験の始まりであり、最も重要な部分です。接着細胞または組織由来細胞を使用する場合でも、サンプルの準備が完全に最適化されていることを確認してください。細胞が正しく採取されていない場合、細胞の生存率が低下する可能性があります。さらに、酵素処理の使用は、研究対象のマーカーの発現に影響を与えないはずです。

すべての固定および透過化溶液がすべての実験設定で機能するわけではなく、検査対象の抗原によって異なる場合があります。

蛍光色素を選択する前に、検討している蛍光色素のレーザー、フィルター、発光スペクトル特性の構成を把握しておくことが重要です。また、使用する機器の機能も把握しておく必要があります。2 つのサイトメーターの機能は同じではありません。知識豊富なスタッフがいるフローサイトメトリー コアがある場合は、お気に入りの 4 色、5 色、または 6 色パネルは何か必ず尋ねてください。また、特定の機器の特定の色の制限についても説明できるはずです。低密度で発現する抗原を検出するには明るい蛍光色素を選択し、高密度で発現する抗原を検出するには暗い蛍光色素を選択するようにしてください。蛍光色素の選択は補正にも重要であり、「明るい」蛍光色素がスペクトルの重なりの問題を引き起こす可能性があることを考慮する必要があります。

すべての実験と同様に、コントロールの選択は非常に重要です。コントロールの選択によって、アッセイが正しく機能しているかどうかを最終的に判断でき、結果の重要な部分を形成するからです。ワークフローには、次の種類のコントロールを組み込むことをお勧めします。

可能であれば、死んだ細胞を識別して除去すると、特異的染色を減らすのに役立ちます。死んだ細胞は、膜の完全性が失われた細胞に浸透する DNA 染料を使用して検出できます。

ダブレットは、2 つの細胞がくっついて 1 つとして分析されるときに発生します。これにより、レーザー インタロゲーション ポイントを通過する「細胞」の蛍光強度が誤って増加します。前方散乱 INT と前方散乱飛行時間 (ToF)、または側方散乱 INT と側方散乱飛行時間 (ToF) を使用してウィンドウを作成することで、ダブレットをゲーティングします。これに続いて、細胞を分析する前にフィルター処理して、細胞塊を除外します。

理想的には、サンプルはすぐに分析する必要がありますが、常にそうできるとは限りません。サンプルをすぐに分析できない場合は、100µl の固定液 (例: 1～2% ホルムアルデヒド) に再懸濁し、4°C で遮光して最大 24 時間保管します。

フローサイトメトリー実験の最適化における重要なステップは、試薬（抗体）滴定です。これにより、バックグラウンドを最小限に抑えながら、蛍光信号の特異性と強度を向上させることができます。

フローサイトメトリー実験の最適化における重要なステップは、試薬（抗体）滴定です。これにより、バックグラウンドを最小限に抑えながら、蛍光信号の特異性と強度を向上させることができます。

蛍光色素が周囲光によって劣化するのを防ぐため、染色された細胞や染色中の細胞が入ったプレートやチューブは、サンプルをホイルなどで覆うか、その他の遮光手段で保護する必要があります。