セルの同期方法

セル同期とは何ですか?

細胞の同期は、培養内の細胞周期のさまざまな段階にある細胞を同じ位相にするプロセスです。細胞同期は、細胞周期を通じて細胞の進行を研究するために使用されます。


セルはどのように同期されますか?

セルは 2 つの異なる方法で同期および分離できます。
化学的遮断
物理的分別


1. 化学的遮断


名前が示すように、この方法ではチミジンなどの化学物質を使用して代謝反応をブロックします。これは、主に細胞周期の S 期中に DNA 合成を阻害することで実現できます。チミジン、アミノプテリン、ヒドロキシ尿素、シトシン アラビノシドなどの阻害剤は、さまざまな影響を与える可能性があります。血清により細胞が 24 時間飢餓状態になると、G1 期の細胞が蓄積します。血清飢餓の影響は、細胞の同調が起こった後に培地に血清を添加することによって逆転させることができます。


2. 物理的分別


物理的分画または細胞分離技術は、細胞密度、細胞サイズ、細胞表面エピトープ上の抗体の親和性、および標識細胞による光散乱または蛍光発光に基づくことができます。

遠心分離またはフルオレセン活性化セルソーティングは、主に物理的分画に使用されます。遠心分離により、サイズと沈降速度に基づいて細胞を分離できます。蛍光活性化セルソーティング (FACS) は、光散乱 (細胞サイズなど) または蛍光発光 (DNA、RNA、タンパク質、抗原の浸透による) によって検出できる差異に基づいて細胞を分類します。これは、フローサイトメーターまたは蛍光活性化セルソーターを使用して実行できます。


関連リソース

細胞周期の段階

細胞周期は 3 つの主要な段階として存在します。
G0/G1 期 – その後の細胞分裂に備えた細胞の休息と回復
S 期 – DNA 複製 (間期)
G2/M 期 – 染色体の分離と有糸分裂
細胞周期の段階
以下のサンプル プロトコルは最適化されており、化学的遮断による細胞の同期に焦点を当てています。前述したように、さまざまな化学物質が細胞周期のさまざまな段階で細胞の同期を誘導する可能性があります (以下の表を参照)。


細胞周期段階をターゲットとする  
使用した治療法
G1逮捕
ダブルチミジンブロック、血清飢餓。サイクリン依存性キナーゼ (CDK) の阻害
G2逮捕
微小管の阻害、サイクリン依存性キナーゼ (CDK) の阻害
G2/M逮捕
RO-3306
M相
タキソール、ノコダゾール


ダブルチミジンブロックによる細胞同期

ステップ/手順
1.       G1/S 境界の細胞を同期させるために、新たに調製したチミジン溶液 (16 mM) を                  完全培地で調製し、0.22 μm フィルターディスクを使用してフィルター滅菌しまし              た。
2.       細胞 (1 X 10 7 個) を、175 cm 3 の細胞培養フラスコ内で、チミジン (2 mM) を含む             60 ml の完全培地中で 16 時間培養しました。
3.
          次いで、細胞を完全培地（52.5 ml）に8時間再懸濁して、細胞が細胞周期に再びる              ようにした。
4.
           細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、完全培地（１０ｍｌ）で２               回  洗浄した。細胞（1 X 10 7 個）をチミジン（2mM）を含む60 mlの完全培地で16             時間培養し、G1/S境界で細胞を同期させました。
5.
           細胞の同期はフローサイトメトリーによって確認されました。


ノコダゾール治療による細胞同期

ステップ/手順
1.   細胞 (1 x 107) をノコダゾール (100 nM) で 18 時間処理することで有糸分裂を同期させ、175 cm2 のチャンバー内で 37 °C でインキュベートしました。


2.   細胞を完全培地X3で洗浄し、完全培地に再プレーティングし、放出後0、30、60、120および180分でサンプルを採取した。


3.    対照として、細胞を有糸分裂状態に維持するためにノコダゾール(100nM)の存在下で1つのサンプルを再播種し、放出後180分にサンプルを採取した。


4.    細胞をRIPA緩衝液中で溶解し、全細胞抽出物を調製した。サンプルは-20 °Cで保存されました。

Cdk阻害剤による有糸分裂同期細胞の処理

ステップ/手順
1.
K562 細胞は、前述のようにダブル チミジン ブロック (DTB) によって G1/S 期で停止しました (最初のサンプル プロトコールを参照)
2.
細胞を４００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、完全培地（１０ｍｌ）で２回洗浄した。
3.
次いで、細胞(1×106/ml)を完全培地に再懸濁し、1時間放置した。
4.
細胞をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO) またはタキソール (1 μM) で 11 時間処理しました。 DTB の 12 時間後、細胞をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO) またはキナーゼ阻害剤、BI2536 (10 μM)、ロスコビチン (20 μM)、RO-3306 (9 μM)、プルバラノール A (10 μM) で処理しました。 ) プロテアソーム阻害剤、MG-132 (10 μM) を 2 時間。
5.
細胞をRIPA緩衝液で溶解し、全細胞抽出物を調製した。
6.
サンプルは-20 °Cで保存されました。


Cdk 阻害剤によるタキソール停止細胞の M 期治療

ステップ/手順
1.
細胞 (1 x 106) をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO)、タキソール (1 μM) またはノコダゾール (1 μM) のいずれかで 12 時間処理しました。
2.
細胞をキナーゼ阻害剤ロスコビチン (20 μM) またはロスコビチンとプロテアソーム阻害剤 MG-132 (10 μM) で 2 時間処理しました。細胞を400 x gで5分間の遠心分離によって回収し、30 μlのRIPA緩衝液で溶解しました。
3.
サンプルは-20 °Cで保存されました。


RO-3306-induced G2/M arrest of K562 cells

ステップ/手順
1.
K562 細胞をビヒクル (0.1% (v/v) DMSO) または RO-3306 (9 μM) で 18 時間処理しました。
2.
細胞を完全培地で３回洗浄し、ビヒクル（０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）またはＭＧ－１３２（１０μＭ）のいずれかで処理した完全培地１０ｍｌに再プレーティングした。
3.
サンプルは洗浄後 0、15、30、45、60、および 90 分に採取されました。
4.
K562細胞をRIPA緩衝液で溶解し、全細胞抽出物を調製した。
5.
サンプルは-20 °Cで保存されました。


セル同期の確認

細胞の同期は、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって確認できます。顕微鏡を使用すると、細胞内で実際に何が起こっているかを見ることができます。フローサイトメトリーを使用すると、処理した同期細胞を非同期コントロールと比較できます。簡単に説明すると、プロトコルは次のとおりです。


ステップ/手順
1.
70 % エタノールで細胞を固定し、透過性にします。
2.
40 μg/ml のヨウ化プロピジウムで染色し、25 μg/ml の RNase を加えます (RNA を分解し、DNA のみを確実に染色するため)。
3.
フローサイトメーターでサンプルを実行します。
24th Oct 2024 Sana Riaz

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