1.

TMB基質溶液 がコンタミネーションを起こしている

無色透明な、新しいTMB基質溶液を使用してください。 基質溶液をウェルにピペッティングする前に、清潔なV底リザーバーを使用します。

2.

反応が停止していない

基質反応が停止していない場合、発色し続けます。

3.

プレートリーダーで読み取る前に長く放置されていた

発色し続けます（反応停止溶液が追加されている場合はより遅い速度で発色が続きます）。

4.

実験用ガラス器具からのコンタミネーション

試薬が新鮮で、清潔なガラス器具を用いて調製されていることを確認してください。

5.

明るい場所で基質のインキュベーションが行われた

基質のインキュベーションは暗所で行ってください。 基質が光に晒されないよう、暗い場所で保管してください。 アッセイ中は、光への暴露を最低限にしてください。

6.

ウェルの洗浄が不十分

プロトコルに従ってウェルを洗浄します。

7.

添加された検出試薬が多すぎる

試薬が適切に希釈されていることを確認するか、検出試薬の濃度を下げます。

8.

ブロッキングバッファーが無効（検出試薬がブロッカーと反応している、ウェルが完全にブロックされていないなど）

別のブロッキング試薬を試すか、ウォッシュバッファーにブロッキング試薬を加えます。

9.

インキュベーション/ウォッシュバッファーの塩濃度

塩濃度を上げると、非特異的および/または弱いオフターゲット反応を減らすことができます。

10.

抗体濃度が高い

最適な結果を得るために、希釈濃度を振ってください。

11.

基質添加時にウェル内に沈殿物が形成される

サンプルの希釈率を上げるか、基質の濃度を下げます。

12.

プレートが汚れている

プレートの底をきれいにします。

13.

標準曲線が誤った希釈濃度で作られた

ピペッティング技術を確認してください。 ピペットの校正が必要になる場合があります。

14.

推奨よりも長いインキュベーション時間

インキュベーション時間が正しいことを確認し、マニュアルに記載されているプロトコルに従ってください。

15.

プレートシーラーまたは試薬リザーバーを再利用したため、残留していたHRPにより、TMBが反応してしまった

プレートシーラーを再利用すると、残留HRPがTMBと反応する可能性があります。 これを避けるため、各ステップで新しいプレートシーラーとリザーバーを使用します。

16.

バッファーのコンタミネーション

常に新しいバッファーを調製します。

17.

サンプル中に測定対象因子が含まれていない、あるいは検出限界以下

サンプル中の測定対象因子濃度が検出限界を下回っている場合、大量のサンプルを使用することで解決する可能性があります。プロトコルの適切な変更については、テクニカルサポートに確認してください。

18.

サンプル中の測定対象因子の濃度がスタンダードの最高値を超えている

サンプルをさらに希釈する必要があります

19.

不十分な洗浄

適切な洗浄を行います。各洗浄ステップの最後に、プレートを裏返してペーパータオル上で完全に取り除きます。必要に応じて残留液を取り除くために強く叩きます。

20.

プレートシーラーを使用していない、あるいは再利用している

インキュベーション中は、アッセイプレートをプレートシーラーで覆います。 プレートを開くたびに新しいシーラーを使用してください。 これにより、ウェルへのコンタミネーションを防ぎます。

21

誤った希釈を行った

ピペッティング手技を確認します。希釈率の計算を再確認します。

22.

推奨より長時間のインキュベーション

キットのプロトコルは最適化されています。 推奨されているインキュベーション時間に従ってください。 抗体ペアを使用してELISAを組み立てる場合、アッセイを最適化する必要があります。 詳細については、「ELISAの組み立てと最適化」を参照してください。

23.

基質溶液の混合が早すぎて青色に変わった

基質溶液は調製後すぐに使用する必要があります

24.

ストレプトアビジン-HRPが多すぎる

希釈を確認し、必要に応じて滴定します。

25.

HRPが残っていたプレートシーラーまたは試薬リザーバーを再利用したため、TMBが非特異的に青色に変化した

各ステップに新しいプレートシーラーと試薬リザーバーを使用します。

26.

バッファーに金属またはHRPがコンタミネーションしている

新しくバッファーを調製してください。

27.

マルチチャンネルピペットの問題

ピペットを校正してください。

28.

プレート洗浄が適切または均一ではなかった

ピペットチップがしっかりと固定されていることを確認してください。 すべての洗浄ステップで試薬が完全に除去されたことを確認します。

29.

不均質なサンプル

サンプルを良くピペッティングします。

30.

サンプルに粒子状の物質が大量に含まれる

遠心分離により粒子状物質を除去します。

31.

プレートの撹拌が不十分

すべてのインキュベーション段階においては、プレートシェーカーを使用して、ウェルの溶液がこぼれない程度の一定の速度でプレートを撹拌する必要があります。

32.

ウェル間でのコンタミネーション

プレートシーラーを再利用するときは、試薬がシーラーに触れていないことを確認してください。 試薬の添加に使用した際のピペットチップを使用する場合は注意が必要です。 ピペットチップがプレート上の試薬に触れないようにしてください。

33.

インキュベーション中にプレートを積み重ねた

プレートを積み重ねると、ウェル全体へ均一に温度を分散できません。 積み重ねないでください。

34.

ピペッティングが安定していない

ピペットが正しく機能し、校正されていることを確認してください。ピペットチップが十分に押し込まれていることを確認してください。 プレートを希釈するときは特に注意し、ピペットチップが正しい量の液体を吸引・放出していることを確認してください。

35.

抗体希釈液/試薬が十分に混合されていない

すべてのウェルで一貫した濃度を確保するために、プレートにピペッティングする前にすべての試薬とサンプルがよく混合されていることを確認してください。

36.

プレートが乾燥してしまった

インキュベーション中はプレートシーラーを使用してください。 インキュベーターの底に滅菌水の入ったトレイを加湿用に置きます。

37.

プレートの底が汚れている

プレートリーダーへかける前に、プレートの底を綺麗にしてください

38.

ウェルに泡がある

プレートリーダーへかける前に、ウェル中に気泡がないことを確認してください

39.

エッジ効果

プレートとすべての試薬が室温に戻されていることを確認してください

40.

保管条件

試薬とサンプルが正しい温度で保管されている（されていた）ことを確認してください

41.

捕捉抗体がプレートに結合していない

細胞培養プレートではなく、ELISAプレートを使用していることを確認してください。 PBSで抗体を希釈します。 コーティングとブロッキングの両方のステップで、正しく調製されたこととインキュベーション時間を確認してください。

42.

プロトコルが一定していない

キットに付属しているプロトコルを順守してください。

43.

標準曲線の不適切な計算

計算を再確認し、新しい標準曲線を作成し、内部コントロールを使用してください。

44.

バッファーのコンタミネーション

新しいバッファーを使用します。

45.

ウェル底が削られている

ピペッティング中にウェルの底に触れないようにしてください。 ピペットチップをウェルの側面に向けて、底を削らないようにします

46.

ウェルがコンタミネーションしている

シーラーを適切に使用して、ウェル間でのコンタミネーションを避けてください。 プレート上の試薬に触れることなくマルチチャンネルピペットを使用してください。

47.

使用される試料に内因性の測定対象因子あるいは干渉がある

交差反応しうるマトリックス成分を確認します（インターロイキン変性組織培養培地など）。

48.

不十分な洗浄

洗浄回数を増やします。 基質を添加する前に、洗浄間の浸漬時間を増やします。

49.

交差反応性

コーティング抗体が検出抗体と交差反応を起こす場合は、 適切なコントロールをおきます。

50.

抗体の非特異的結合

ブロッキングのステップが手順に含まれており、適切なブロッキングバッファーが使用されていることを確認します。 同じ種類の二次抗体の5〜10％の血清、またはウシ血清を使用することをお勧めします。 非特異的な付着を防ぐためにウェルが前処理されていることを確認します

51.

結合二次抗体の濃度が高すぎる

希釈して、至適濃度を決定します。

52.

誤ったアッセイ温度

インキュベーション温度が37°Cを超えていないことを確認してください。

53.

不適切な洗浄

すべてのウェルがウォッシュバッファーで満たされ、完全に吸引されたことを確認します。 利用可能な場合は、自動プレートウォッシャーを使用します。 洗浄回数を増やします。 洗浄の間に30秒の浸漬ステップを追加します。

54.

サンプルに酵素が混入している

基質のみでサンプルをテストし、混入酵素の活性を確認します。

55.

ウェルの洗浄が不十分

ウェルの洗浄はプロトコルごとの推奨に従ってください。

56.

ウォッシュバッファーにコンタミネーションがある

新しいバッファーを調製してください。

57.

検出試薬量が過多

試薬が適切に希釈されていることを確認するか、検出試薬の推奨濃度を下げます。

58.

ブロッキングバッファーが効いていない

別のブロッキングバッファー試薬を試す、またはウォッシュバッファーにブロッキング試薬を追加する。

59.

インキュベーション/ウォッシュバッファーの塩濃度

塩濃度を上げると、非特異的および/または弱いオフターゲット反応を減らすことができます。

60.

反応停止液の添加後、プレートを読み取るのに時間がかかりすぎている

反応停止液を加えた後はすぐにプレートを読んでください。

61.

抗体濃度が高い

最適な結果が得られるよう，様々な希釈濃度を試してください。

62.

明るい場所で基質のインキュベーションが行われた

基質のインキュベーションは暗所で行ってください。 基質が光に晒されないよう、暗い場所で保管してください。 またはメーカーの推奨に従ってください。

63.

基質添加時にウェル内に沈殿物が形成される

サンプルの希釈率を上げるか，基質の濃度を下げてください。

64.

プレートが汚れている

プレートの底を綺麗に拭いてください。

65.

異なる検出抗体を加えたか、全く加えていない

適切な検出抗体を追加して続行します。

66.

Avidin-HRPが添加されていない

プロトコルに基づいてAvidin-HRPを追加して続行します

67.

基質溶液が添加されていない

基質溶液を追加して続行します

68.

ウォッシュバッファーにアジ化ナトリウムが含まれている

ウォッシュバッファーにはアジ化ナトリウムを使用しないでください。

69.

インキュベーション時間が短すぎる

4度で一晩インキュベートするか、製造者の指示に従ってください。

70.

測定対象因子が検出限界以下しか含まれていない

希釈率を下げるか、サンプルを濃縮します

71.

サンプルの種類が非対応

テストされていないサンプルの種類では、検出が減少または欠落する場合があります。 ポジティブコントロールを使用してください。

72.

吸着プレートによってエピトープの認識が阻害された

直接または間接ELISAによるペプチドの検出を強化するには、マイクロタイタープレートにコーティングする前にペプチドを大きなキャリアタンパク質に結合させます。

73.

アッセイバッファーの非互換性

アッセイバッファーが目的のターゲットと互換性があることを確認します（酵素活性の保持、タンパク質相互作用の保持など）

74.

不十分な検出試薬

メーカーの指示に従って検出試薬の量の濃度を上げてください。

75.

誤って調製されたサンプル

適切なサンプル調製/希釈を確認してください。 サンプルは、マイクロタイタープレートアッセイ形式と互換性がない可能性があります。

76.

抗体量が不十分

異なる濃度での抗体の希釈を試してください

77.

インキュベーション温度が低すぎる

インキュベーションが正しい温度で行われていることを確認してください。 プレートを含むすべての試薬は、室温にするか、続行する前に製造元の推奨に従ってください。

78.

誤った波長で読み取っている

波長の設定を確認し、プレートを再度読み取ります

79.

プレート洗浄が強すぎる

自動プレートウォッシャーの圧力を確認します。 手動で洗浄する場合は、ピペットでバッファーを静かに洗浄します。

80.

ウェルが乾燥してしまった

アッセイを開始した後は、ウェルを乾燥させないでください。 すべてのインキュベーションでは、シーリングフィルムまたはシーリングテープを使用してプレートを覆います。

81.

発色が遅い

使用直前に基質溶液を調製します。 ストック溶液の有効期限が切れておらず、コンタミネーションを起こしていないことを確認してください。 より長いインキュベーションも試してください。

82.

発色にムラがある

すべてのウェルが正しく洗浄されていることを確認し、可能であればELISAプレートウォッシャーを使用してください

83.

試薬温度を室温に戻していない

すべての試薬は、アッセイの開始から室温でなければなりません。 ベンチで15〜20分後ほど置き、室温に戻す必要があります。

84.

期限切れの試薬

使用するすべての試薬が期限内であることを確認してください

85.

アッセイ方法が適していない

より感度の高いアッセイタイプに切り替えます（例：直接ELISAからサンドイッチELISA）。 インキュベーション時間を長くするか、温度を上げます。 または、検出方法を変更します。

86.

バッファーにウシ胎児血清（FBS/FCS）が含まれている

使用した試薬を再確認します。

87.

スタンダードが不完全に再構成されたか、誤って保存された

プロトコルに従ってスタンダードを再構成し、保管温度はプロトコルに従ってください。

88.

試薬が誤った濃度でウェルに添加された

ピペッティングエラーを確認し、試薬量を修正します

89.

不正確な温度でインキュベーションされた

保存、インキュベーション、および攪拌はプロトコルに従ってください

90.

ウェルから残液が完全に吸引されていない

ステップ間で残液を完全に吸引し、可能な場合はプレートウォッシャーを使用します

91.

インキュベーション中にプレートを積み重ねた

プレートは積み重ねないでください。

92.

段階希釈に問題がある

プロトコルに従って希釈ステップを確認します

93.

試薬の混合不良

試薬を完全に混合するようにしてください

94.

プレートへの試薬の吸着ムラ

コーティングバッファーは通常、pH 7.4のPBSまたはpH 9.6の炭酸水素塩緩衝液を使用します。インキュベーション時間を延長するか、異なるプレートの使用を検討してください

95.

スタンダードが劣化した

スタンダードが正しく保存されていたことを確認します。

96.

曲線がスケールにフィットしない

例えば log-log、5パラメーターロジスティックカーブフィット等、別のスケールを使用してプロットを試してください。

97.

ピペッティングエラー

ピペットを確認して校正してください。

98.

捕捉抗体がプレートに結合していない。

培養プレートではなく、ELISAプレートを使用していることを確認してください。

99.

検出抗体量が不十分

希釈を確認し、必要に応じて滴定します

100.

標準曲線の計算を誤っている

計算を確認し、新しい曲線を作成します。

101.

別キットの試薬を混ぜたり、代替として使用している

アッセイに影響を与える可能性があるため、避けてください。