変換プロトコル – サンプル変換プロトコル (Transformation Protocol – Sample Transformation Protocols)

プラスミドによる細菌の形質転換は、細菌の研究において注目されるだけでなく、哺乳動物細胞における遺伝子発現の研究​​にも使用できます。ほとんどのプラスミドは細菌起源であり、細菌の複製起点と選択マーカーとして使用できる抗生物質耐性遺伝子の両方を含んでいます。形質転換のプロセスにより、外来 DNA が細胞に導入されます。

さまざまな細菌株に遺伝子改変を加えて、形質転換しやすくすることができます。このような修飾は、プラスミド DNA を再構成することなくプラスミドを維持します。特定の処理は細菌の形質転換効率を高めることが示されています。これらの処理により、細胞は化学的または電気的変換を受けやすくなり、一般に「コンピテントセル」と呼ばれるものが生成されます。

細菌の形質転換効率を高めるために、実際の形質転換プロセスの前にプレインキュベーションのステップを組み込むことができます。プレインキュベーションには、細菌細胞を特定の増殖条件にさらすかストレスを誘導することが含まれ、これにより外来 DNA を取り込む能力が強化されます。これらのプレインキュベーションステップを慎重に最適化することで、研究者は細菌の形質転換効率を大幅に向上させ、下流のアプリケーションでより良い結果を得ることができます。

選択された DNA 配列を選択的に単離、増幅、増殖させる能力は生物学の基礎であり、羊のドリーのようなよく知られたクローン作成の例を超えて、幅広い実用的応用を提供します。細菌の 2 つの古典的な形質、プラスミドと制限エンドヌクレアーゼを利用することにより、DNA クローニングは目的の DNA 配列の増幅を可能にします。

細菌内で一般的に見られるプラスミドは、クローニング目的に有利な特徴をいくつか備えています。これらは染色体 DNAとは別に自律的に複製でき、通常は二本鎖で環状構造です。この環状の性質により、外来 DNA を受け入れるのに理想的となり、その結果、組換えプラスミドが形成されます。これらの組換えプラスミドには、それ自体の DNA と増幅対象として選択された DNA セグメントの混合物が含まれています。さらに、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ、複製起点、カナマイシンまたはアンピシリン耐性などの選択マーカーなどの必須構成要素を保持しています。

組換えプラスミドの形成後、形質転換と呼ばれるプロセスを通じてそれらを細菌に戻すことができます。通常、これは細菌細胞を有能にすることによって達成され、多くの場合熱ショックを与えることによって達成されます。この技術は細胞膜を弱め、細菌による組換えプラスミドの取り込みを促進します。

形質転換後、プラスミドまたはベクターの取り込みに成功する細菌をスクリーニングまたは選択できます。これは通常、細菌ブロスを寒天上にプレーティングすることによって達成されます。たとえば、目的の遺伝子がIL-18プロモーターであるシナリオを考えてみましょう。このプロモーターは、 β-ガラクトシダーゼをコードするプラスミド上の LacZ 遺伝子に挿入できます。通常、β-ガラクトシダーゼは X-Gal を分解し、青色のコロニーを生成します。ただし、目的の遺伝子が正常に挿入されると、β-ガラクトシダーゼの発現が阻害され、寒天プレート上でコロニーが白く見えます。

これらの確立された技術を拡張することで、研究者は細菌の形質転換プロトコルを利用して、生物学研究やそれ以外のさまざまな用途に特定の DNA 配列を操作および増幅できます。

*これらは変換プロトコルによって異なる場合があります

• コンピテントセル
• LB寒天
• SOCメディア
• 抗生物質（カナマイシン/アンピシリン）
• スプレッダー
• 培養皿
• 37℃のシェーカーインキュベーター
• 37℃のキャビネットインキュベーター
• 37℃の水浴
• 遠心
• 氷

1. プラスミド DNA の増幅には大腸菌株 DH5 Alpha を使用しました。
2. 細胞は塩化カルシウム法によりコンピテントにされた。
3. 形質転換されていない DH5 アルファを LB (Luria Bertani) 寒天 (10g/L トリプトン、5g/L 酵母エキス、10g/L NaCl、pH 7.0) 上に画線し、15g/L 寒天を補充し、37 °C で一晩インキュベートしました。
4. 次いで、明確に定義されたＤＨ５アルファコロニーをＬＢ寒天プレートから採取し、２００ｒｐｍで振盪しながら５ｍｌのＬＢ（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で一晩増殖させた。
5. 次いで、一晩培養物１mlをLBで150mlに希釈し、OD600が0.4〜0.6に達するまで増殖させた。
6. 4℃、800gで10分間の遠心分離により細胞を回収しました。
7. 10 ml の氷冷した滅菌 0.1 M CaCl2 に再懸濁し、氷上で 5 分間インキュベートします。
8. 再遠心分離後、細胞を2mlの0.1M CaCl2に再懸濁し、70μlのDMSOを添加した。
9. 細胞を氷上で15分間再度インキュベートした。200 μl のアリコートを -80 °C で保存しました。

1. 凍結したコンピテントセルを氷上で解凍した。
2. 細菌の 100 μl アリコートを解凍しました。
3. 次いで、２μｌの所望のプラスミドを添加し、細胞／プラスミド混合物を氷上で３０分間インキュベートした。
4. 細胞に42℃で40秒間のヒートショックを与え、その後氷上で2分間回復させることによってプラスミドの取り込みを誘導した。
5. 次いで、５００μｌのＬＢを添加し、細胞を低撹拌（２２０ｒｐｍ）下で１時間インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子を発現させた。
6. 細胞の１００μｌアリコートをアンピシリン（１００×ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングして、プラスミドを有する形質転換体を選択した。
7. ディッシュを裏返し、37℃で一晩インキュベートしました。

1. 大腸菌XL1の単一コロニーを5mlのLB培地に植菌し、振盪機上で37℃で一晩培養した。
2. 5mlの培養物を、滅菌250mlフラスコ中の100mlのLB培地に添加し、600nmでの吸光度(OD600nm)が0.6AUに達するまで、37℃で振盪機上で培養した。
3. 培養物を50mlチューブに移し、氷上で10分間冷却した。
4. サンプルを1700 RCFで10分間遠心分離し、上清を除去した。
5. 細菌細胞ペレットを使用して、ペレットをdH2O中の40%グリセロール2mlに再懸濁することによってグリセロールストックを調製した。
6. 100μlを1.5mlチューブに等分し、液体窒素を使用して急速冷凍し、-80℃で保存した。
7. プラスミド DNA で形質転換する前に、大腸菌XL1のグリセロール ストックを-80 °C の保管庫から取り出し、2700 RCF で 5 分間遠心分離して細胞をペレット化しコンピテントにしました。
8. 上清を除去し、ペレットを１０μｌのＴｆｂＩ緩衝液（３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ塩化ルビジウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ塩化マンガン、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、酢酸含有ｐＨ５．８、濾過滅菌）に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。
9. 懸濁液を２７００ＲＣＦで５分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを１０μｌのＴｆｂＩＩ緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、７５ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ルビジウム、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ＮａＯＨ含有ｐＨ６．５、フィルター滅菌済み）に再懸濁した。

1. 上記のように調製したコンピテント大腸菌XL1細胞（10μl）（調製コンピテント大腸菌細胞（サンプルプロトコール2））を2μlのプラスミドDNAとともにインキュベートし、時々混合しながら氷上に30分間置いた。
2. サンプルは 37 °C の水浴中で 2 分間熱ショックを受け、その後氷に移されました。
3. 次に細胞を1 mlのLBブロスに加え、37℃で60分間振盪機上に置き、続いて3000 RCFで3分間遠心分離した。
4. 上清を除去して100μlを残し、ペレットを残りの上清に再懸濁した。
5. サンプルのアリコート（100μl）を、30μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートした。

一晩の増殖後、細菌細胞を遠心分離によりペレット化し、大腸菌からプラスミドを精製します。その後、マルチサンプル マイクロボリューム UV-Vis 分光光度計 NanoDrop 800 または同様の機器を使用してプラスミド DNA を定量できます。DNA は、短期の場合は -20°C、長期の場合は -80°C で保存できます。

1. 温度 –温度は変換において非常に重要な役割を果たし、実験の効率に大きな影響を与える可能性があります。正しい温度は 3 つの段階で重要です。 解凍、氷上およびヒートショック中の DNA と細胞のインキュベーション。

• 解凍 –細胞は氷上で解凍するのが最適です。細胞は手で解凍できますが、0 °C を超える温度に温めると効率が低下します。氷の最後の痕跡が消えたらすぐに DNA を追加する必要があります。
• DNA と細胞を氷上でインキュベート –理想的には、氷上で 30 分間インキュベートします。このステップを 10 分短縮するごとに、TE の 2 倍の損失が予想されます。
• 熱ショック –化学イオンと急激な温度変化 (つまり「熱ショック」) の組み合わせにより、細菌の細胞壁と膜の透過性が変化し、DNA 分子が細胞内に侵入できるようになる可能性があります。最適な結果を得るには、ヒートショックの前後に細胞懸濁液を氷冷してください。ヒートショックを与える前に、温度計を使用してウォーターバスが 42℃に達していることを確認してください。

2. 細菌の再懸濁 –細胞が完全に再懸濁されていない場合、プラスミドは大部分の細菌細胞と接触できなくなります。細胞は、塊が見えなくなるまでピペットで上下させて再懸濁する必要があります。また、再懸濁中に細胞が熱くならないようにしてください。これは、後のヒートショックに影響します。細胞が入っているチューブの底部ではなく上部を持ち、手で細胞を温めないようにするのが良いでしょう。

3. 形質転換体がない –最初の最も明白なステップは、正しい抗生物質を含む LB 寒天プレートにプレーティングしていることを確認することです。プラスミド上の耐性遺伝子は、プレート上の抗生物質と一致する必要があります。また、変換手順が確実に機能するようにポジティブ コントロールを追加する必要があります。当然のことながら、プラスミド DNA が少なすぎると形質転換効率が低下しますが、プラスミドを追加しすぎると結果に影響を与える可能性があることをご存知ですか? 時には少ない方が良いこともあります。直観に反するように思えるかもしれませんが、特に高コンピテントセルを使用する場合、より少ない DNA でより高い形質転換効率が得られることがよくあります。ライゲーションで 100 ～ 1000 ng の全 DNA を使用した場合、1 μl を直接使用するよりも 1:5 または 1:10 希釈の 1 μl を使用すると、より多くのコロニーが得られることがよくあります。

4. 増殖時間–細胞の回復と抗生物質耐性の発現には、37°C​​ で 1 時間の増殖が最適です。このステップを短縮する 15 分ごとに、TE の 2 倍の損失が予想されます。チューブを振盪または回転させながらインキュベートすると、TE が 2 倍高くなります。