二次抗体

一次抗体は、特定の標的抗原またはタンパク質に結合する抗体です。 一方、二次抗体は、目的の抗原/タンパク質を標的とする一次抗体に結合します。 二次抗体は一次抗体の重鎖に結合します。 これにより、一次抗体と標的抗原/タンパク質の結合の間に干渉がないことが保証されます。

二次抗体は、主に標的分析物の検出と精製に使用されます。 二次抗体には、多くの場合、その構造にラベルまたはタグが追加されています。 そのようなコンジュゲート（またはそのようなコンジュゲートの副産物、例えばHRP酵素反応のTMB生成物）の検出を介して、目的のタンパク質に関する情報を収集することができます。 例えば、サンプル内のタンパク質の濃度を決定することができ、タンパク質を顕微鏡で視覚化することができ、またはタンパク質を複雑な溶液から精製することができる。

二次抗体を使用する主な理由は2つあります。 第一に、二次抗体は一次抗体の種とアイソタイプ（ほとんどの場合IgG）にのみ特異的でなければなりません。 一方、一次抗体は、それが標的とする個々の抗原またはタンパク質に対して特異的でなければなりません。 このため、二次抗体は、個別に標識された一次抗体よりもはるかに用途が広いです。

第二に、二次抗体はシグナル増幅を助けます。 これは、複数の二次抗体が1つの一次抗体に結合できるためです。 これにより、二次抗体を使用する実験室での実験の感度が大幅に向上します。

二次抗体は、それらの起源の種、アイソタイプ、およびコンジュゲートに応じて構造が異なります。

前に説明したように、二次抗体が一次抗体に結合するためには、抗体の種とアイソタイプに特異的でなければなりません。 二次抗体は、一次抗体または検体の両方とは異なる種で作成する必要があります。 これは、二次抗体とサンプル内の他の天然抗体との交差反応性を回避するためです。

たとえば、テスト対象のサンプルがマウスから取得された場合、使用される一次抗体は、マウス以外の種、たとえばヤギigG分子からのものでなければなりません。 さらに、二次抗体がサンプルに追加される場合、この抗体は一次抗体とは異なる種のものでなければならず、サンプル、例えばウサギIgG分子を使用することができます。

したがって、選択される二次抗体の種類は、サンプルのソースと一次抗体によって異なります。

二次抗体の最も一般的なアイソタイプは免疫グロブリンG（IgG）です。 これは、異なる種のIgG分子が互いに結合するのに優れているためです。 免疫グロブリン分子IgGのサブクラスには、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4が含まれます。 他の免疫グロブリンアイソタイプには、IgA、IgD、IgE、およびIgMが含まれます。 これらは二次抗体としてあまり一般的に使用されていませんが、同じ場合は適用されます。 類似の免疫グロブリン分子のみが互いに結合します。

二次抗体構造の別の変数は、そのコンジュゲートです。 選択されるコンジュゲートのタイプは、二次抗体の使用によって異なります。 たとえば、抗原またはタンパク質の濃度を測定する必要がある実験（ELISA、ウエスタンブロット）では、酵素タグを使用できます。 HRPと発色が測定されます。 酵素反応の結果として生成される色は、サンプル内のタンパク質の量に比例します。 一般的に使用されるコンジュゲートの別のタイプは、蛍光コンジュゲートです。 蛍光コンジュゲートは、蛍光抗体法や免疫組織化学などの実験で使用して、サンプル内のタンパク質を視覚化したり、タンパク質がサンプル内に存在するかどうかを確認したりできます。

一般的な二次抗体コンジュゲートには以下が含まれます：

西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）-酵素
アルカリホスファターゼ（AP）-酵素
ビオチン-酵素
FITC-フルオロフォア
酢酸アミノメチルクマリン（AMCA）-フルオロフォア
ローダミン-フルオロフォア
Cy3-フルオロフォア

• 酵素免疫測定法（ELISA）

  
  ウエスタンブロット

  
  免疫組織化学

  
  免疫細胞化学

  
  免疫蛍光

  
  フローサイトメトリー